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本试剂盒采用常规的碱裂解法裂解细胞，经过沉淀，离心除去基因组DNA、蛋白质和RNA，经吸附柱选择性地吸附DNA，再通过简单的洗涤步骤除去非特异性结合的杂质，洗脱得到纯度较高的质粒，经内毒素清除液进一步纯化。可直接用于转化、DNA测序、PCR、基于PCR的突变、体外转录、酶切等后续实验。

• 操作过程快速、方便。整个抽提过程可以在30分钟内完成。
  
• 低内毒素污染。

• 加入RNase A后，Buffer P1请存放于2～8℃，有效期为半年。
  
• Buffer P3中含有刺激性的化合物，操作过程中应穿上实验服，戴好乳胶手套，避免沾染皮肤、眼睛和衣服，防止吸入口鼻。沾染皮肤或眼睛后，请立即用清水或生理盐水冲洗，必要时寻求医生的帮助。

• 自备试剂：无水乙醇等。
  
• 试剂盒初次开启，将RNase A全部加入至Buffer P1中，混匀后在瓶身做好标记，储存于2～8℃，有效期为6个月。
  
• Buffer P2和Buffer P3在低温下可能产生沉淀，使用前请检查，如有沉淀，请于37℃溶解，待冷却至室温后使用。
  
• 按瓶身标签说明在Wash Solution中加入4倍体积的无水乙醇，混匀后在瓶身做好标记，于室温密封保存。每次使用后将瓶盖盖紧，以保持Wash Solution中的乙醇含量。若Wash Solution由于运输或保管不当造成容量不准，请用量筒定容后再加入相应体积的无水乙醇。
  
• 液相内毒素清除试剂在高于20℃的环境中容易产生分层或变浑浊，请在使用前放在冰上，充分混匀后再使用。
  
• 提前将水浴锅调至60℃备用。

• 在含合适抗生素的培养基中接种目标菌株，于37℃摇床充分振荡培养12～16h。
  
  • 菌液状态对质粒得率非常关键，请用不超过容器容量1/4体积的培养基进行培养。
    
  • 处于生长平台期的菌体用于质粒抽提得率最高，过度培养可能导致DNA降解。
• 对于高拷贝质粒，取75～175mL菌液，10000rpm离心3min，收集菌体，倒尽或吸干培养基。
  
  • 菌液用量与菌液浓度密切相关，建议最大菌液用量不要超过500/OD600mL.
    
  • 对于低拷贝数的质粒，请用150～350mL细胞，同时按比例相应提高Buffer P1、Buffer P2和Buffer P3的用量。
    
  • 如果使用更多的菌液，则同一个样品分多管收集，分别裂解，合并同一个样品的各管裂解液通过同一个吸附柱来获得更高的得率。
• 在菌体沉淀中加入10mL Buffer P1，吸打或振荡至彻底悬浮菌体。
  
  • Buffer P1首次使用时请检查是否已加入RNase A。
    
  • 一定要彻底悬浮菌体，否则影响得率和质量。
    
  • 如果使用Visualysis，则在加入10mL P1后再加入40μL Visualysis，振荡混匀。
    
  • Visualysis需在临用前加入，直接加入到Buffer P1中出现浑浊为正常现象。
• 加入10mL Buffer P2，立即温和颠倒离心管5～10次混匀，室温静置2～4min。
  
  • 裂解时间与菌量相关，菌量多则适当延长时间，最长不能超过5分钟。
    
  • 如果同时操作多个样品，每加入一管混匀一管，不要采用全部加入一起混匀的方法，计时从第一管样品加入开始。
    
  • 以溶液由浑浊变澄清且粘稠，为裂解完全的标志。
• 加入14mL Buffer P3，立即上下颠倒5～10次，室温放置5min。
  
  • 如果同时操作多个样品，每加入一管混匀一管，不要采用全部加入一起混匀的方法。加入Buffer P3后，离心管中会立即出现大量白色絮状沉淀。
    
  • 如果起始菌液较多，混匀后室温静置2分钟以彻底去除RNA。
• 12000rpm离心15min。
  
  • 离心后溶液应为澄清的，如果还混有微小悬浮物可再次离心，或延长离心时间，待完全沉淀后再取上清。
• 将上清全部小心移入吸附柱，室温放置5min，8000rpm离心2min。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。
  
  • 如果裂解液较多，可以重复该步骤直至所有裂解液流过吸附柱。
    
  • 不要吸取到沉淀，否则会出现基因组DNA和蛋白质污染。
    
  • 如果上清中有沉淀浮起，可以将一片滤纸折叠成漏斗型装在吸附柱上，对倒入的上清进行过滤。
• （Optional）向吸附柱中加入5mL Buffer DW1，8000rpm离心2min。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。
  
• 向吸附柱中加入5mL Wash Solution，8000rpm离心2min。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。
  · Wash Solution首次使用前请检查是否已加入正确量的无水乙醇。
  
• 重复步骤9一次。
  
• 将空吸附柱和收集管放入离心机，10000rpm离心2min。
  
  • 此步绝不可省略，否则残余的乙醇会严重影响得率和后续实验。
    
  • 可将离心后的吸附柱放入恒温箱中50℃干燥5分钟，或自然晾干10分钟。有助于乙醇挥发完全。
• 将吸附柱放入干净的50mL离心管中，在吸附膜中央加入2mL Elution Buffer，室温静置2min，10000rpm离心2min。将所得到的质粒DNA溶液置于-20℃保存或用于后续试验。
  
  • Elution Buffer为2.5mM Tris-HCl，pH8.5，可以用TE或水（pH>7.0）代替。
    
  • 将Elution Buffer预热至60℃可以进一步提高得率。
    
  • 请勿使用小于1mL的洗脱液进行洗脱。
• 加入适量体积的双蒸水或Elution Buffer到质粒洗脱液中，使其总体积达到5mL，加入500μL 3M醋酸钠溶液（pH5.2），充分混匀，置于冰上放置5min。
  
• 加入500μL预冷的Liquid Endotoxin Eliminator，充分混匀，冰上放置10min。
  
• 65℃温浴直到溶液浑浊或分层，通常需要1～5min。
  
• 高于25℃条件下，8000rpm（水平转头最大转速）离心5min。
  
  • 为了使上下层之间有明显的分界，需在一定的温度下离心。温度过低可使两相不分层。
• 用去内毒素的枪头将上层液体移至去内毒素的离心管中。
  
  • 此步可去除90%的内毒素，如果需要可进一步去除内毒素。
    
  • 重复步骤13～16三次，可进一步降低内毒素水平。
• 向离心管中加入3倍体积的乙醇，充分混匀，冰上放置30min。
  
• 8000rpm（水平转头最大转速）离心10min，弃去上清，用无内毒素的75%乙醇洗涤2次。
  
• 开盖倒置5～10min，彻底晾干残余的乙醇。
  
  • 此步不可省略，否则残余的乙醇会严重影响得率和后续实验。
• 加入适量无内毒素的水溶解DNA，将所得到的DNA溶液置于-20℃保存或用于后续试验。
  
  • 如milipore or hyclone的超纯系统处理过的水，或直接溶解在无菌注射用水中。